pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對照載體

【??參數(shù)信息】

英文名稱：pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對照載體

載體類型：酵母雙雜交系統(tǒng)載體

載體大小：7.9kb

原核抗性：Kanamycin, Kan

克隆菌株：DH5α

載體標(biāo)簽：c-Myc

篩選標(biāo)記：TRP1

啟動(dòng)子：ADH1

表達(dá)宿主： 酵母細(xì)胞

5'測序引物：T7: TAATACGACTCACTATAGGG

3'測序引物：根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物

純度：≥95%

儲存條件：-20℃避光干燥

生產(chǎn)廠商：西安強(qiáng)化生物科技

【簡單概述】

pGBKT7-Lam是一種用于酵母雙雜交系統(tǒng)的陰性對照載體，由基礎(chǔ)載體pGBKT7改造而來。

pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對照載體其核心特征包括：

結(jié)構(gòu)組成：

表達(dá)人核纖層蛋白C（Lamin C）與GAL4 DNA結(jié)合域（DNA-BD）的融合蛋白，其中Lamin C包含66–230位氨基酸片段，DNA-BD包含1–147位氨基酸片段。

含c-Myc表位標(biāo)簽，便于融合蛋白的免疫檢測。

啟動(dòng)子系統(tǒng)：ADH1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)融合蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；T7啟動(dòng)子支持體外轉(zhuǎn)錄翻譯。

抗性標(biāo)記：原核宿主（如大腸桿菌）使用KanR，真核宿主（酵母）使用TRP1營養(yǎng)篩選標(biāo)記。

復(fù)制原點(diǎn)：2μ ori（酵母）和pUC ori（大腸桿菌），支持雙宿主復(fù)制。

載體大小：7.9 kb（含插入片段）。

設(shè)計(jì)目的：

作為酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化陰性對照，用于檢測假陽性相互作用背景。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

（一）載體轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒擴(kuò)增（大腸桿菌）

感受態(tài)準(zhǔn)備：使用DH5α等克隆菌株，冰上解凍感受態(tài)細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化：

取2μl質(zhì)粒加入100μl感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30分鐘。

42℃熱激90秒，冰浴2分鐘。

加入900μl無抗LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)45分鐘。

離心（6000 rpm, 5分鐘）后重懸菌體，涂布于含卡na霉素（50μg/ml）的LB平板。

驗(yàn)證：挑取單克隆擴(kuò)增后，通過酶切（如BamHI/PstI）或測序（引物T7 Forward）確認(rèn)載體正確性。

（二）酵母轉(zhuǎn)化（酵母雙雜交系統(tǒng)）

酵母菌株：常用Y2HGold、AH109等。

共轉(zhuǎn)化要求：

陰性對照設(shè)置：需與pGADT7-T（或空pGADT7）共轉(zhuǎn)化，形成完整對照系統(tǒng)。

陽性對照：pGBKT7-53 + pGADT7-T（驗(yàn)證系統(tǒng)有效性）。

轉(zhuǎn)化步驟：

制備酵母感受態(tài)細(xì)胞（如LiAc/PEG法）。

加入pGBKT7-Lam及配對載體（如pGADT7-T），冰浴30分鐘。

42℃熱激15分鐘，涂布于SD/-Trp/-Leu（DDO）平板篩選共轉(zhuǎn)化子。

（三）陰性對照驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)基篩選：

將共轉(zhuǎn)化酵母接種至四缺培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp，即QDO），添加X-α-gal（顯色劑）和3-AT（抑制弱自激活）。

預(yù)期結(jié)果：

無生長（或微弱生長）：表明無假陽性相互作用。

無藍(lán)色顯色：排除報(bào)告基因（如MEL1）激活。

自激活檢測：若pGBKT7-Lam單獨(dú)轉(zhuǎn)化酵母后在QDO/X平板上生長，需優(yōu)化3-AT濃度抑制自激活。

（四）結(jié)果分析與注意事項(xiàng)

假陽性排查：若陰性對照在QDO/X/A培養(yǎng)基生長，需檢查載體構(gòu)建是否污染或?qū)嶒?yàn)操作誤差。

毒性檢測：觀察酵母菌落大小，若顯著小于陽性對照，提示融合蛋白可能有毒性。

保存：轉(zhuǎn)化成功的酵母菌株可加甘油凍存于-80℃。

【相關(guān)試劑】

DAF-FM DA (5mM in DMSO)

Sodium Nitroprusside(SNP)

S-Nitrosoglutathione(GSNO)

K599 Chemically Competent Cell

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Ar 1193 Chemically Competent Cell

ER-TrackerTM Blue-White DPX, for live-cell imaging

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本試劑僅適用于科研實(shí)驗(yàn)，敬請知悉。