L4440 Vector

標(biāo)題：L4440 Vector 線蟲RNAi干擾載體

【參數(shù)信息】

英文名稱：L4440 Vector

載體用途：線蟲RNAi干擾載體

載體大小：2790bp

原核抗性：氨芐青霉su（Ampicillin, Amp）

克隆菌株：DH5α

啟動(dòng)子：T7

復(fù)制子：pUC

質(zhì)粒標(biāo)簽：lacZN, OriF1

表達(dá)宿主：線蟲

誘導(dǎo)方式：IPTG

純度：≥95%

5'測序引物：根據(jù)全序列設(shè)計(jì)

儲存條件：-20℃避光干燥

生產(chǎn)廠商：西安強(qiáng)化生物科技

【簡單概述】

L4440是一種用于RNA干擾（RNAi）實(shí)驗(yàn)的雙T7啟動(dòng)子質(zhì)粒載體。

其核心特性包括：

（一）載體結(jié)構(gòu)：

環(huán)狀質(zhì)粒，全長2790 bp，攜帶氨芐青霉su抗性基因用于細(xì)菌篩選。

包含兩個(gè)反向排列的T7啟動(dòng)子，中間為多克隆位點(diǎn)，允許插入目標(biāo)基因片段。

含復(fù)制起始位點(diǎn)、lac操縱子及IPTG誘導(dǎo)元件。

（二）克隆方式：

通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行定向克隆，目標(biāo)基因片段插入MCS后，兩側(cè)T7啟動(dòng)子可同時(shí)驅(qū)動(dòng)其轉(zhuǎn)錄，形成反向互補(bǔ)RNA鏈，在胞內(nèi)退火形成雙鏈RNA。

（三）宿主系統(tǒng)：

需轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HT115菌株。該菌株缺乏RNase III，且攜帶IPTG誘導(dǎo)的T7 RNA聚合酶基因，確保dsRNA穩(wěn)定表達(dá)。

【L4440載體的使用方法】

（一）載體構(gòu)建流程

引物設(shè)計(jì)與基因克隆：

設(shè)計(jì)含限制酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增目標(biāo)基因片段。

選擇與載體MCS匹配的雙酶切位點(diǎn)，避免片段內(nèi)部存在相同位點(diǎn)。

雙酶切與連接：

L4440載體和目標(biāo)基因分別用相同限制酶雙酶切，凝膠電泳回收片段。

T4 DNA連接酶連接載體與基因片段（16℃過夜）。

轉(zhuǎn)化與篩選：

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，涂布含氨芐青霉su的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。

驗(yàn)證：

菌落PCR或測序確認(rèn)重組質(zhì)粒。

（二）轉(zhuǎn)化宿主菌HT115

宿主特性：RNase III缺陷型菌株，減少dsRNA降解；含DE3區(qū)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶。

轉(zhuǎn)化步驟：

冰浴中將重組質(zhì)粒加入HT115感受態(tài)細(xì)胞，輕混后靜置30分鐘。

42℃熱激60–90秒，快速冰浴冷卻。

加入SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩復(fù)蘇45–60分鐘。

涂布含氨芐青霉su的平板，37℃培養(yǎng)12–16小時(shí)。

（三）dsRNA誘導(dǎo)與線蟲喂食

誘導(dǎo)表達(dá)：

挑取單菌落接種LB（含Amp），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4–0.5。

加入IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)2–4小時(shí)。

喂食法操作：

制備NGM平板：含25 μg/mL羧芐青霉su和1 mM IPTG。

點(diǎn)板：150 μL誘導(dǎo)菌液涂布平板，室溫干燥。

喂食：轉(zhuǎn)移L4期線蟲至平板，避免攜帶原菌株。

表型觀察：

4天后觀察子代表型。

（四）顯微注射法（備選）

適用場景：喂食法無效或需快速驗(yàn)證。

步驟：

純化dsRNA或重組質(zhì)粒。

用顯微注射針注射線蟲性腺，角度15°平行于體軸。

注射后滴加恢復(fù)緩沖液，避免機(jī)械損傷致死。

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本試劑僅適用于科研實(shí)驗(yàn)，敬請知悉。