pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對(duì)照載體

【??參數(shù)信息】

英文名稱：pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對(duì)照載體

載體類型：酵母雙雜交系統(tǒng)載體

克隆菌株：DH5α

載體標(biāo)簽：c-Myc

篩選標(biāo)記：TRP1

啟動(dòng)子：ADH1

表達(dá)宿主：酵母細(xì)胞

5'測(cè)序引物：T7: TAATACGACTCACTATAGGG

3'測(cè)序引物：根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物

純度：≥95%

儲(chǔ)存條件：-20℃避光干燥

生產(chǎn)廠商：西安強(qiáng)化生物科技

【簡(jiǎn)單概述】

pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對(duì)照載體，其核心功能是表達(dá) GAL4 DNA 結(jié)合域（DNA-BD）與小鼠p53 蛋白片段的融合蛋白，用于驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的可靠性。

關(guān)鍵特征

載體結(jié)構(gòu)

融合蛋白組成：

GAL4 DNA-BD（氨基酸 1-147）：負(fù)責(zé)結(jié)合靶基因啟動(dòng)子。

小鼠 p53 蛋白（氨基酸 72-390）：已知與 SV40 大 T 抗原相互作用的腫瘤抑制蛋白。

啟動(dòng)子：ADH1 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)融合蛋白的高水平表達(dá)。

標(biāo)簽：c-Myc 表位標(biāo)簽，便于抗體檢測(cè)。

克隆位點(diǎn)：p53 cDNA 插入 EcoRI 和 BamHI 位點(diǎn)之間。

載體參數(shù)

大?。?.3 kb或 8275 bp。

抗性基因：

原核抗性：Kanamycin。

真核篩選標(biāo)記：TRP1。

復(fù)制子：

pUC ori（大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)）。

2μ ori（酵母復(fù)制起點(diǎn)）。

來(lái)源

p53 cDNA 源自 Lwabuchi 等（1993）描述的質(zhì)粒，經(jīng) Clontech 改造。。

【使用方法】

一、載體特性與用途

載體本質(zhì)：

編碼 GAL4 DNA結(jié)合域（BD, 1-147aa） 與 小鼠p53蛋白（72-390aa） 的融合蛋白，用于模擬已知蛋白質(zhì)相互作用（如p53與SV40大T抗原）。

作為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的可靠性（例如：當(dāng)與pGADT7-T共轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)激活報(bào)告基因）。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）載體準(zhǔn)備

質(zhì)粒溶解：

收到凍干粉后，5000 rpm離心1分鐘，加入20 μl無(wú)菌水重懸，室溫放置1分鐘。

測(cè)定濃度（建議≥100 ng/μl），保存于-20℃。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（大腸桿菌）：

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 DH5α 等感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，Kan（50 μg/ml）篩選。

挑取單菌落擴(kuò)增，提取高純度質(zhì)粒備用（避免直接使用凍干粉）。

（二）酵母轉(zhuǎn)化與對(duì)照實(shí)驗(yàn)

酵母感受態(tài)制備：

使用 Y2HGold 或 AH109 等標(biāo)準(zhǔn)酵母菌株，制備感受態(tài)細(xì)胞（如LiAc/PEG法）。

共轉(zhuǎn)化（陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置）：

實(shí)驗(yàn)組：pGBKT7-53（誘餌） + pGADT7-T（獵物，編碼SV40 T抗原）。

陰性對(duì)照：

pGBKT7-53 + 空pGADT7載體

pGBKT7-Lam（編碼Lamin C，無(wú)互作） + pGADT7-T。

轉(zhuǎn)化操作：

將質(zhì)粒（0.1–1 μg）與感受態(tài)酵母混合，熱激（42℃, 15分鐘），涂布于 SD/-Trp 平板（篩選pGBKT7-53轉(zhuǎn)化子）。

30℃培養(yǎng)3–5天，挑取直徑≥2 mm的單菌落。

（三）自激活與毒性檢測(cè)（關(guān)鍵質(zhì)控）

自激活測(cè)試：

將含pGBKT7-53的酵母菌落接種至：

SD/-Trp（基礎(chǔ)篩選）

SD/-Trp/-His/X-α-Gal（或 QDO/X/A 培養(yǎng)基）。

若在缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并顯藍(lán)色（報(bào)告基因激活），說明p53融合蛋白可能自激活，需調(diào)整3AT濃度抑制。

毒性檢測(cè)：

比較轉(zhuǎn)化子與空載體對(duì)照的生長(zhǎng)速度，若生長(zhǎng)延遲則提示蛋白毒性。

（四）互作篩選（以篩庫(kù)為例）

交配法（Mating）：

將含pGBKT7-53的 Y2HGold 菌株與含文庫(kù)（pGADT7-XXX）的 Y187 菌株混合，30℃培養(yǎng)24–48小時(shí)。

涂布于 DDO（SD/-Leu/-Trp） 和 QDO（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal） 平板，篩選陽(yáng)性克?。≦DO上生長(zhǎng)且顯藍(lán)）。

陽(yáng)性克隆驗(yàn)證：

菌落PCR：使用載體特異性引物（如T7啟動(dòng)子引物）擴(kuò)增插入片段。

測(cè)序鑒定：排除重復(fù)克隆，比對(duì)序列確認(rèn)互作蛋白。

點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證：將候選獵物質(zhì)粒與pGBKT7-53再次共轉(zhuǎn)化，重復(fù)互作實(shí)驗(yàn)。

【相關(guān)試劑】

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